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當(dāng)前位置：熒光顯微鏡的工作原理
更新時(shí)間：2020-12-30 點(diǎn)擊次數(shù)：2814
光源
多用采200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。
燈室必須有良好的散熱條件
，工作環(huán)境溫度不宜太高。新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃
，使用一些時(shí)間后
，則需要高壓?jiǎn)?dòng)（約為15000V），啟動(dòng)后
，維持工作電壓一般為50～60V
，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命
，在每次使用2h的情況下約為200h
，開動(dòng)一次工作時(shí)間愈短
，則壽命愈短，如開一次只工作20min
，則壽命降低50%
。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)
。燈泡在使用過程中
，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)
。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉
，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min
。由于超高壓汞燈壓力很高
，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃
，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸
。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流
、啟動(dòng)幾個(gè)部分
。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡
，前面安裝有集光透鏡
。
濾色系統(tǒng)
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào)，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名
，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃
，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)
。
1．激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類激發(fā)濾板
，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光
。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過
。常用型號(hào)為UG-1或UG-5
，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波
。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過
。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3
，外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過
。常用型號(hào)為QB24（BG12）
。
開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)
，波長(zhǎng)適當(dāng)
，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板
，均比玻璃濾板效果好
。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板
，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些
。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的熒光
。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)
，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過
。能與UG-1或UG-5組合
。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍(lán)光壓制濾板：能通過510nm以上波長(zhǎng)的光（綠到紅）
，能與BG-12組合
。通常用OG-4K510或OG-1K530。
紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長(zhǎng)的光（藍(lán)到紅）
，可與BG-3組合
，常用OG-11K470AK 490，K510
。
反光鏡
其反光層一般是鍍鋁的
，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上
，而銀的反射只有70%
；一般使用平面反光鏡。
聚光鏡
專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成
。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種
。還有相差熒光聚光器。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器
，它具有聚光力強(qiáng)
，使用方便，特別適于低
、中倍放大的標(biāo)本觀察
。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛
。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外
，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡
，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度
，壓制濾板也可以很薄
，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景
。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度
，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適
，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒
。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察
，既能看到熒光圖像
，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確
。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。
目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡
，如5×和6.3×
。過去多用單筒目鏡
，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上
，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便
。
落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后
，波長(zhǎng)短的部分（紫外和紫藍(lán)）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45
。傾斜時(shí)
，則垂直射向物鏡
，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)
，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用
。同時(shí)，濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分（綠
、黃
、紅等），對(duì)濾鏡是可透的
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，因此
，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用
，由于標(biāo)本的熒光處在可見光長(zhǎng)波區(qū)
，可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高
，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。
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